Un canal TRPV3 pentamérica con un poro dilatado. | Insertos de fresado Foshan Co., Ltd

Naturaleza (2023)Cita este artículo

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Los canales de potencial receptor transitorio (TRP) son una gran superfamilia de canales iónicos eucarióticos que controlan diversas funciones fisiológicas y, por lo tanto, son objetivos farmacológicos atractivos1,2,3,4,5. Se han determinado más de 210 estructuras de más de 20 canales TRP diferentes, y todas son tetrámeros4. A pesar de esta riqueza de estructuras, muchos aspectos relacionados con los canales TRPV siguen siendo poco conocidos, incluido el fenómeno de dilatación de los poros, mediante el cual la activación prolongada conduce a una mayor conductancia, permeabilidad a iones grandes y pérdida de rectificación6,7. Aquí, utilizamos microscopía de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM) para analizar el TRPV3 incrustado en la membrana a nivel de molécula única y descubrimos un estado pentamérico. Las imágenes dinámicas HS-AFM revelaron transitoriedad y reversibilidad del pentámero en equilibrio dinámico con el tetrámero canónico a través del intercambio de protómero difusivo de membrana. La población de pentámeros aumentó con la adición de anhídrido difenilborónico (DPBA), un agonista que se ha demostrado que induce la dilatación de los poros de TRPV3. Sobre la base de estos hallazgos, diseñamos un proceso de producción de proteínas y análisis de datos que resultó en una estructura de microscopía electrónica criogénica del pentámero TRPV3, que muestra un poro agrandado en comparación con el tetrámero. La cinética lenta para entrar y salir del estado pentámero, el aumento de la formación de pentámero tras la adición de DPBA y el poro agrandado indican que el pentámero representa el correlato estructural de la dilatación de los poros. Por lo tanto, mostramos el intercambio de protómeros por difusión de membrana como un mecanismo adicional para los cambios estructurales y la variabilidad conformacional. En general, proporcionamos evidencia estructural para un ensamblaje de canal TRP pentamericano no canónico, sentando las bases para nuevas direcciones en la investigación del canal TRP.

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Todos los datos y materiales para sacar las conclusiones de este artículo se presentan en el texto principal, las figuras y las figuras de datos ampliadas y videos complementarios. Los mapas crio-EM del tetrámero y pentámero TRPV3 se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica con los códigos de acceso EMD-40181 y EMD-40183, respectivamente, y sus modelos estructurales se han depositado en el PDB con los códigos de acceso 8GKA y 8GKG. respectivamente (Tabla de datos ampliados 1). Se pueden recibir más datos del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos a A. Accardi y J. Dittman por importantes debates. Los datos de EM de tinción negativa se recopilaron en los servicios de microscopía electrónica e histología del núcleo de análisis de imágenes y microscopía de medicina Weill Cornell utilizando un microscopio electrónico de transmisión adquirido con fondos de una subvención de instrumentación compartida de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (n.º S10RR027699) para Recursos compartidos. Los datos de Cryo-EM se recopilaron en el Centro de Microscopía Electrónica Simons del Centro de Biología Estructural de Nueva York, con el apoyo de la Fundación Simons (subvención nº SF349247). El trabajo en el laboratorio de Scheuring está financiado en parte por subvenciones del NIH, Centro Nacional de Salud Complementaria e Integrativa (NCCIH), subvención no. DP1AT010874 (a SS) y el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS), subvención no. R01NS110790 (a SS). El trabajo en el laboratorio de Yuan está parcialmente financiado por la subvención no. NIH NINDS R01NS099341 (a PY). El trabajo en el laboratorio de Nimigean está parcialmente financiado por la subvención no. NIH NIMGS R01 GM088352 (a CMN) y concesión no. NIH NIMGS F32 GM145091 (a EDK). SL recibió el Premio al Desarrollo Profesional Postdoctoral para Mujeres del Instituto Weizmann de Ciencias.

Departamento de Anestesiología, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Shifra Lansky, John Michael Betancourt, Yining Jiang, Elizabeth D. Kim, Crina M. Nimigean y Simon Scheuring

Programa de Posgrado en Neurociencia, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Juan Miguel Betancourt

Departamento de Biología y Fisiología Celular, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Saint Louis, MO, EE. UU.

Jingying Zhang y Peng Yuan

Centro para la Investigación de Enfermedades de Excitabilidad de Membranas, Facultad de Medicina de la Universidad de Washington, Saint Louis, MO, EE. UU.

Jingying Zhang y Peng Yuan

Departamento de Ciencias Farmacológicas, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Jingying Zhang y Peng Yuan

Programa de Bioquímica y Biología Estructural, Biología Celular y del Desarrollo y Biología Molecular, Escuela de Graduados en Ciencias Médicas, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Yining Jiang

Programa de Biología Estructural, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Nueva York, NY, EE. UU.

Navid Paknejad

Programa de Posgrado en Fisiología, Biofísica y Biología de Sistemas, Weill Cornell Medical College, Nueva York, NY, EE. UU.

Navid Paknejad

Departamento de Fisiología y Biofísica, Weill Cornell Medicine, Nueva York, NY, EE. UU.

Crina M. Nimigean y Simon Scheuring

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SL y SS diseñaron el estudio. JZ y PY expresaron y purificaron proteínas de células de P. pastoris. SL, JMB y EDK expresaron y purificaron proteínas de células HEK GnTI-. Proteína reconstituida SL y JMB. SL realizó imágenes EM con tinción negativa. SL, EDK y CMN realizaron y analizaron mediciones de electrofisiología. SL y JMB realizaron imágenes HS-AFM. SL e YJ realizaron análisis de datos HS-AFM. SL y JMB realizaron experimentos y análisis de nanoDSF. SL y JMB realizaron la preparación de muestras crio-EM y la recopilación de datos. SL, EDK y NP analizaron datos crio-EM de una sola partícula. SL y SS realizaron análisis de la estructura del canal. YJ realizó y analizó la simulación de oligómeros. SL y SS escribieron el artículo. Todos los autores editaron el manuscrito. SS supervisó el proyecto.

Correspondencia a Simon Scheuring.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature agradece a Ute Hellmich, Thomas Voets y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Estructuras representativas (de >210 estructuras) de los 23 canales TRP resueltos hasta el momento. Todas las estructuras son tetrámeros, con las cuatro subunidades coloreadas en trigo, verde, morado y amarillo. Cada estructura se representa en una representación de superficie, mostrada desde las vistas intracelular (arriba) y lateral (abajo). El signo de interrogación en el panel crTRP1 significa que aún se desconoce la subfamilia a la que pertenece crTRP1.

( a ) y ( b ) Grabaciones representativas de un solo canal de TRPV3 en ausencia (a) y presencia (b) de DPBA 100 μM, a −50 y 50 mV. ( c ) Curvas de corriente-voltaje (IV) de TRPV3 obtenidas de −100 a 100 mV, en ausencia y presencia de DPBA 100 μM. (d) Probabilidades abiertas de un solo canal determinadas a partir de registros obtenidos a −50 mV, en ausencia y presencia de DPBA 100 μM. Los valores de probabilidad abierta (0,27 ± 0,01 y 0,78 ± 0,05 respectivamente) se derivaron como valores medios +/− sem de n ≥ 3 experimentos independientes (círculos). La significación estadística se evaluó con la prueba T de Welch de una cola, lo que produjo un aumento significativo (valor de p = 0,0007) en la probabilidad de canal abierto después de la adición de DPBA. Todos los registros se realizaron en canales TRPV3 de una purificación siguiendo el mismo protocolo de purificación y expresión de proteínas que para el análisis crio-EM, y se reconstituyeron siguiendo el mismo protocolo que para el análisis HS-AFM, aunque con una relación lípido-proteína más alta (LPR). entre 5 y 20 para registros de electrofisiología versus LPR entre 0,5 y 2,5 para experimentos HS-AFM). *** valor p < 0,005.

(a) a (f) Transiciones de tetrámero a pentámero. (g) a (k) Transiciones de pentámero a tetrámero. (l) Transición tetrámero-pentámero-tetrámero. (m) Transición pentámero-tetrámero-pentámero-tetrámero-pentámero-tetrámero. Las puntas de flecha blancas indican los monómeros observados ocasionalmente que "atacan" y se insertan en tetrámeros para producir pentámeros, y los monómeros observados que se disocian de los pentámeros para producir tetrámeros.

(a) Los tetrámeros y pentámeros de TRPV3 coexisten junto con los fragmentos de protómeros de TRPV3 ≤ 3. Las puntas de flecha grises indican fragmentos de monómero (1), dímero (2) y trímero (3). (b) y (c) Desintegraciones del tetrámero TRPV3 en trímero y dímero. (d) Los fragmentos de TRPV3 forman un tetrámero estable, que luego se rompe.

Diagrama de flujo para el procesamiento de datos crio-EM, selección, clasificación y reconstrucción de partículas, que permite la reconstrucción del mapa del tetrámero con una resolución de 2,55 Å y del pentámero con una resolución de 4,38 Å. A menos que se indique lo contrario, todos los pasos del procesamiento se realizaron en la versión 3.3.2 de cryoSPARC. Las líneas discontinuas indican las entradas utilizadas para los ciclos iterativos de refinamiento heterogéneo.

(a) y (b) Mapas reconstruidos por Cryo-EM del tetrámero (a) y pentámero (b) de TRPV3, coloreados según la resolución local utilizando una escala de colores del arco iris. (c) y (d) Densidades crio-EM representativas del tetrámero (nivel de contorno a 5,5 RMSD) (c) y pentámero (nivel de contorno a 4,16 RMSD) (d), a una resolución de 2,55 Å y 4,38 Å, respectivamente (los TMD en el mapa de pentámero tienen una resolución de ~5,0-5,5 Å; consulte el esquema de colores de resolución local en (b)).

(a) y (b) estructuras del tetrámero (a) y pentámero (b) de TRPV3, coloreadas según los dominios: ARD en morado, VSLD en amarillo, PD en rosa, SF en verde, hélice TRP en trigo, dominio de acoplamiento en azul claro . (c) a (e) Superposición de una subunidad de pentámero (púrpura) sobre la subunidad de tetrámero (verde), alineada con respecto a la PD, lo que indica un movimiento de bisagra en el monómero de pentámero de 18º, como se manifiesta por la rotación del ARD ( c), VSLD y hélice TRP (d). Este movimiento de bisagra permite la preservación de las interacciones entre subunidades de S5 con S1 y S4, y las interacciones SF-SF y S6-S6 (e). Subunidades vecinas en gris. Gráficos de libro abierto de las áreas de contacto entre subunidades del tetrámero (f, verde) y pentámero (g, morado). Las áreas de contacto están coloreadas en rosa (en el tetrámero) y amarillo (en el pentámero).

Los tetrámeros de TRPV3 pueden disociarse. La disociación se ve favorecida por la activación, debido a la desestabilización de la interacción entre protómeros, en particular la interfaz de intercambio de dominio VSLD-PD, por moléculas que intercalan hélices (p. ej., capsaicina o LPA en TRPV1, DPBA en TRPV3, temperatura). Los monómeros pueden "atacar" e insertarse en tetrámeros para producir pentámeros con un diámetro de poro agrandado estimado ~ 2,4 veces en el SF. Los pentámeros, con una vida útil de ~3 minutos, son menos estables que los tetrámeros debido a que las interfaces VSLD-PD son más frágiles y eliminan subunidades para recuperar el estado tetramérico (figura creada con BioRender.com).

(a) Visualización de trazas simuladas. Cada columna representa un espacio independiente que puede estar vacío (0) u ocupado por una molécula con un estado oligomérico específico (1, 2, 3, 4 o 5). Espacio total: 5250. Paso de tiempo total: 2000. Configuración inicial (paso de tiempo = 1): 5000 de 5250 espacios tenían un valor de 4 (tetrámeros) y 250 de 5250 espacios tenían un valor de 0 (vacío). (b) y (c) Vistas en primer plano de los rastros simulados en (a) como lo indican los cuadros discontinuos. 1: Transición vacía → monómero → dímero → trímero → tetrámero → pentámero. 2: Transiciones entre estados de tetrámero y pentámero (con tiempos de permanencia cortos en el pentámero). 3: Un evento largo de estado pentámero. 4: pentámero → tetrámero → trímero → dímero → monómero → transición vacía. ( d ) Evolución temporal de los recuentos de oligómeros. Panel superior: Tetrámeros. Panel medio: pentámeros y oligómeros inferiores (trímero, dímero y monómero) agregados. Panel inferior: Trímeros, dímeros y monómeros. (e) Tiempos de permanencia en el estado del oligómero. De izquierda a derecha: oligómeros inferiores (n = 34984), tetrámero (n = 278141) y pentámero (n = 331579).

Este archivo contiene Figs complementarias. 1–6, Tablas 1–3 y Código.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,80 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3. Velocidad de fotogramas, 2 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,80 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,27 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,40 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela varios canales con estados oligoméricos pentaméricos. Velocidad de fotogramas, 1,5 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,33 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela varios canales con estados oligoméricos pentaméricos. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,50 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela varios canales con estados oligoméricos pentaméricos. Velocidad de fotogramas, 0,5 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,48 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela varios canales con estados oligoméricos pentaméricos. Velocidad de fotogramas, 2 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,40 nm por píxel.

Vídeos HS-AFM de alta resolución de canales TRPV3 tetraméricos. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,20 nm por píxel.

Vídeos HS-AFM de alta resolución de un canal TRPV3 tetramérico y pentamericano. Velocidad de fotogramas, 0,3 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,12 nm por píxel.

Vídeos HS-AFM de alta resolución de canales pentamericanos TRPV3. Velocidad de fotogramas, 1,5 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,25 nm por píxel.

Vídeos HS-AFM de alta resolución de un canal TRPV3 tetramérico y pentamericano. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,35 nm por píxel.

Vídeos HS-AFM de alta resolución de un canal TRPV3 tetramérico y pentamericano. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,20 nm por píxel.

Vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela una transición tetrámero-pentámero. El panel izquierdo muestra una descripción general de la reconstitución de TRPV3. El panel superior derecho muestra la transición tetrámero-pentámero de una sola molécula. El panel inferior derecho muestra el promedio (t,t + 2) de la transición tetrámero-pentámero de una sola molécula. Velocidad de fotogramas, 2 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,28 nm por píxel.

Vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela una transición tetrámero-pentámero. El panel izquierdo muestra una descripción general de la reconstitución de TRPV3. El panel superior derecho muestra la transición tetrámero-pentámero de una sola molécula. El panel inferior derecho muestra el promedio (t,t + 2) de la transición tetrámero-pentámero de una sola molécula. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,32 nm por píxel.

Vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela dos transiciones pentámero-tetrámero. El panel izquierdo muestra una descripción general de la reconstitución de TRPV3. El panel superior derecho muestra las transiciones pentámero-tetrámero de una sola molécula. El panel inferior derecho muestra el promedio (t,t + 2) de las transiciones pentámero-tetrámero de una sola molécula. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,25 nm por píxel.

Video HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela transiciones de pentámero-tetrámero. El panel izquierdo muestra una descripción general de la reconstitución de TRPV3. El panel superior derecho muestra la transición pentámero-tetrámero de una sola molécula. El panel inferior derecho muestra el promedio (t,t + 2) de la transición pentámero-tetrámero de una sola molécula. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,35 nm por píxel.

Video HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 que revela transiciones completas de tetrámero-pentámero-tetrámero. El panel izquierdo muestra una descripción general de la reconstitución de TRPV3. El panel superior derecho muestra la transición tetrámero-pentámero-tetrámero completa de una sola molécula. El panel inferior derecho muestra el promedio (t,t + 2) de la transición tetrámero-pentámero-tetrámero completa de una sola molécula. Velocidad de fotogramas, 1,5 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,33 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 en presencia de DPBA 320 μM, que revela varios canales con estados oligoméricos pentaméricos. Velocidad de fotogramas, 1 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,40 nm por píxel.

Descripción general del vídeo HS-AFM de la reconstitución de TRPV3 en presencia de DPBA 320 μM, que revela varios canales con estados oligoméricos pentaméricos. Velocidad de fotogramas, 2 s por fotograma. Muestreo de píxeles, 0,67 nm por píxel.

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Reimpresiones y permisos

Lansky, S., Betancourt, JM, Zhang, J. et al. Un canal TRPV3 pentamérica con un poro dilatado. Naturaleza (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06470-1

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Recibido: 18 de enero de 2023

Aceptado: 21 de julio de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06470-1

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